細胞培養中細胞污染的鑒別

細胞培養過程中如果操作不當或者條件控制不合適見容易受到化學或者生物因素的污染，常見的污染源有：　

1、細菌污染

　　細菌污染是實驗室細胞培養中常見的污染，即使在細胞培養液中加入了抗菌素，也可能因為操作不慎而引起污染。最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。

　　培養細胞受細菌污染后，會出現培養液變混濁，pH改變。污染后細胞發生病理改變，胞內顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。

2、真菌污染

　　真菌污染是細胞培養過程中最常見的一種，最常見的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。

　　培養細胞受真菌污染后，可見培養液中漂浮著白色或淺黃色的小點，有的散在生長，培養液一般不發生混濁；倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯在細胞之間或培養基中，有的呈鏈狀排列。

　　真菌污染后，細胞生長變慢，但最后由于營養耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。

3、支原體污染

　　支原體是介于細菌與病毒之間能獨立生活的最小微生物，最小直徑0.2μm，一般過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形態結構。開始不易發現，能在偏堿條件下生存，對青霉素有抗藥性。多吸附于細胞表面或散在于細胞之間。

　　培養細胞受支原體污染后，部分敏感細胞可見細胞生長增殖變慢，部分細胞變圓，從瓶壁脫落。但多數細胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時處理，還會產生交叉污染。

4、病毒污染

　　組織細胞培養過程中，如果沒有除去潛在的病毒，就會產生病毒污染。目前，從原代猴腎細胞的培養中已發現不少于20種血清性病毒。

盡管病毒污染的細胞不影響原代培養，但生產疫苗是不安全的。因此，潛在病毒是細胞大量生產和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。

5、非同種細胞污染

　　由于細胞培養操作時各細胞株所需的器材和溶液沒有嚴格分開，往往會使一種細胞被另一種細胞污染。目前，世界上已有幾十種細胞都被HeLa細胞所污染，致使許多實驗宣告無效。

   在發現培養的細胞出現生長異常時需要對細胞的污染情況進行鑒別，以利于采取補救措施。常見的污染鑒別方法如下：

　　1、細菌、真菌污染的檢測

　?。?）肉眼觀察

　　細菌、真菌污染常在傳代、換液、加樣等開放性操作之后發生，而且增生迅速，若有污染，在48小時內可明顯觀察到，例如培養液變混濁，或略加振蕩有很多漂浮物漂起。

　?。?）接種觀察

　　采用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養液接種，也可發現是否有污染。

　?。?）鏡下觀察

　　在倒置顯微鏡的高倍鏡下可見培養液中有大量圓球狀顆粒漂浮，即為細菌污染。

　　若細胞之間有絲狀、管狀、樹枝狀或卵形的物質常為真菌污染。

　　2、支原體污染的檢測

　?。?）相差顯微鏡觀察

　　直接取少許培養液滴在載物片上，再蓋上蓋片觀察，支原體在鏡下呈暗色微小顆粒，多位于細胞與細胞之間，有時可見類似于布朗運動的表現。

　　應注意與細胞破碎溢出的內容物如線粒體等相區別。

　?。?）熒光染色法觀察

　　用熒光染料Hoechst33258，此染料能與DNA特異地結合，可使支原體內的DNA著色，熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點，散在于細胞周圍或附于細胞表面。

　　 （3）電鏡檢測

　　若條件許可，可用掃描電鏡或透射電鏡觀察。一般在細胞培養48～72小時，細胞接近匯合前，用胰酶消化細胞制成細胞懸液后進行固定、包埋、切片后才能進行觀察。

　?。?）培養檢測

　　將細胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養基，培養14天后觀察肉湯培養有無霧狀沉淀，然后取0.5ml加入已冷卻到50℃的培養基中，再用瓊脂培養基做分離培養，37℃培養3天觀察有無“荷包蛋”菌落出現。

　　3 、病毒的檢測

　　1) 應用電鏡技術快速診斷動物病毒病

　　冠狀病毒電鏡圖：

　　2) 逆轉錄_聚合酶鏈反應RT_PCR檢測病毒